克倫特羅elisa試劑盒說(shuō)明書（二） 
接著上一篇克倫特羅elisa試劑盒說(shuō)明書（一）的相關(guān)對(duì)于試劑盒說(shuō)明的簡(jiǎn)述，下面本章繼續(xù)對(duì)克倫特羅試劑盒進(jìn)行相關(guān)說(shuō)明。
六、自備實(shí)驗(yàn)器材 1． 酶標(biāo)儀 2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl 3． 洗板機(jī) 4． 37℃孵育箱 5． 超純水，去離子水 6． 一次性稀釋用聚丙烯試管
七、樣本收集及儲(chǔ)存
1. 尿液、血清、血漿樣本不用處理，如果樣本渾濁需過(guò)濾或3000g以上離心15min處理。 2. 組織樣本處理：取搗碎樣本5g，加入20ml，50mmolHCL振動(dòng)1.5h，稱取5g均質(zhì)物，加入離心管，10000r/min離心15min。取上清至另一個(gè)離心管中，加1molNaOH 300ul，混合15min。加入4ml 500mmol KH2PO4(PH3.0),迅速混勻置于4℃冰箱保存1.5h。10000r/min離心15min，分離上清備用。 3. 飼料處理：用研缽研碎飼料樣本，稱取2.0±0.05g研碎的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml 1M 鹽酸溶液，加入16ml去離子水用均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)；
用渦旋儀渦動(dòng)3min，放振蕩器上振蕩15min；3000g以上，離心20min，轉(zhuǎn)移出全部上清液至10ml聚苯乙烯離心管中，并加入2ml 1M氫氧化鈉溶液混合均勻，檢查pH值是否在6.5-7.5之間；（用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值）；3000g以上，離心20min，取100ml上清液至2ml干凈的聚苯乙烯離心管中，加入900ml去離子水混合均勻。取50ul用于分析。 注意事項(xiàng)：如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高 于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。 
八、試劑準(zhǔn)備
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下復(fù)溫。 2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用超純水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。 3. 抗體工作液配制：抗體溶液與稀釋液比例為1:9,例如向4.5ml抗體稀釋液中加入500ul抗體溶液，混勻使用。 4. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：標(biāo)準(zhǔn)品S6為即用型濃度為7290pg/ml，按照濃度為S5:2430pg/ml、S4:810pg/ml、S3:270pg/ml、S2:90pg/ml、S1:30pg/ml進(jìn)行稀釋，具體操作如下圖所示。 
九、檢測(cè)步驟
1 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在標(biāo)準(zhǔn)品與樣本孔中加樣50ul，加入50ul抗體工作液，再加入100ulHRP反應(yīng)液，空白對(duì)照不加 2 37℃避光孵育45min 3 棄去液體，用洗滌液清洗4次，每次每孔至少加洗滌液300ul，洗完后吸水紙上拍干 4 每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育20min，顯色淺可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間 5 加入終止液50ul，10min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值
十、結(jié)果判斷
1. 用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。 2. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 3. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中克倫特羅含量可通過(guò)對(duì)應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 4. 若標(biāo)本 OD 值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
十一、參數(shù)表征
1.數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
| Concentration(pg/ml) | OD1 | OD2 | 空白 | 0 | 0 | 0 | S1 | 30 | 1.278 | 1.298 | S2 | 90 | 1.174 | 1.183 | S3 | 270 | 1.091 | 1.102 | S4 | 810 | 0.884 | 0.892 | S5 | 2430 | 0.549 | 0.555 | S6 | 7290 | 0.272 | 0.276 |
2. 準(zhǔn)確度：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R>0.95
4. 檢測(cè)范圍：30-7290pg/ml(如超出檢測(cè)范圍，需將樣本稀釋后檢測(cè)) 5. 靈敏度：≤30pg/ml 4 特異性：不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng) 5 重復(fù)性：變異系數(shù)≤15% 6 儲(chǔ)存條件：2-8℃冷藏 7 有效期：6個(gè)月
上海原鑫生物科技有限公司：ELISA試劑盒：多種屬、1000多種指標(biāo)：人、大小鼠、通用、牛、兔、山羊、倉(cāng)鼠、豬、馬、雞、犬、豚鼠、猴、綿羊
抗體：兔多抗、鼠單抗品種豐厚，一抗1萬(wàn)余種，二抗100多種； 重組蛋白：多項(xiàng)創(chuàng)造專利，原核表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)蛋白1000余種。 在線聯(lián)絡(luò)：17621047120（周經(jīng)理） QQ：2441609688 （任經(jīng)理） 官方電話：400-788-2680 更多生化生理代測(cè)檢測(cè)：http://www.sdkaiwen.com/product-32-1-1.html |
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